Disertante: DR. PABLO LOPEZ
Buenos días, en primer instancia agradecer a Bioérix y al Dr. Fornella y Dr. Vázquez por la invitación agradecido de compartir con otros especialistas médicos. De poder intercambiar ideas y conocimientos que nos fortalecen a todos.
En el área que me desarrollo es especialmente la citogenética de la biología molecular y específicamente el FISH. Básicamente la experiencia que tengo es en Hemato-oncología, es muy nuevo el desarrollo para tumores sólidos en FISH acá en nuestro medio por lo cual voy a desarrollar de alguna manera en que consiste la técnica y finalmente cual sería su aporte en el cáncer gástrico especialmente en los HER2. La presentación se va basar en estos cuatro puntos donde básicamente se va hablar de la genética del cáncer y las mutaciones genéticas. Se va a basar la charla esencialmente en la hibridación in situ fluorescente FISH donde vamos a ver ahora algunas consideraciones técnicas y que hay que conocer para poder llevarlas a cabo de una manera efectiva, posteriormente vamos a ver alguna aplicación clínica de FISH en la oncología en general y cerramos en algunas consideraciones del HER2 en el cáncer gástrico. Simplemente recordarles que el cáncer es un grupo de las enfermedades la cual se caracteriza por un funcionamiento anormal de uno o más genes que llevan a la proliferación celular que no va a tener ni control ni coordinación generando estas tres características que todos conocemos como es la proliferación, la invasión a los tejidos adyacentes o las metástasis a tejidos distantes. Habitualmente las células normales cuando surge un evento genético adverso la célula es capaz de reparar ese defecto y llevar a la célula a la apoptosis. Cuando escapa a esos mecanismos de control se genera partiendo de una célula que adquiere una ventaja proliferativa, un clon celular, que va a generar la neoplasia. O sea que son eventos genéticos sucesivos, y son a nivel celular y a nivel clonal, pudiendo este evidenciar que a partir de un evento se genera toda una clona igual o posteriormente a esa primera adquisición que genera una ventaja proliferativa, se van agregando nuevos eventos genéticos, que van caracterizando a diferentes sub clones. Entonces nosotros hablamos de una evolución clonal cuando se van adquiriendo diferentes alteraciones genéticas que van caracterizando a los sub clones.
Para lograr esas alteraciones genéticas, se producen por diferentes mecanismos, las mutaciones puntuales habitualmente son un cambio de una base por otra que pueden generar cambios en la expresión de determinados genes. En el caso de que sean proto-oncogenes pueden ser que sean casos de sobreexpresión de determinadas proteínas que van a estimular el crecimiento de la proliferación celular pero también hay otros elementos como la perdida de material que pueden también llevar a una desregulación de genes que estimulan la proliferación celular. Como es conocido el caso de las traslocaciones que lo que hacen es cambiar la disposición en la cual se encuentran determinados genes. Esto hace que determinados genes regulados de determinada manera, en si sitio original, al cambiar de posición se encuentran en un ambiente génico mucho más permisivo que favorece la trascripción de esos genes por lo cual ya sea por la adyacencia de promotores o potenciadores, generan en esa caso una hiperproducción de genes puede llevar a una proliferación celular no controlada. Quiero resaltar las amplificaciones que es el caso más frecuente cuando consideramos al HER2 neu. Las amplificaciones se pueden dar por polisomías, o amplificaciones en Tandem que hacen que un segmento de gen se va a replicar numerosas veces y eso puede tener como efecto una sobreexpresión genética, una sobretranscripción de ese producto como consecuencia de una sobreexpresión a nivel proteico. Esto es un punto que quiero resaltar en relación a lo que la Dra. Musto recién expuso, que la inmunohiastoquímica es una técnica que nosotros vamos a evidenciar, una proteína que está a nivel celular y con el FISH vamos a evidenciar son aquellas alteraciones genéticas que pueden llevar a una sobreprotección de esa proteína. Habitualmente lo que ocurre en estos casos, en el cáncer gástrico HER2 neu positivo, esa sobreprotección proteica esta generada por una amplificación a nivel génico. En algunos casos hay alguna discordancia donde la presencia de una amplificación no se expresa por una sobreexpresión a nivel proteico.
Hay una clasificación de los genes vinculados al desarrollo tumoral, pudiéndose clasificar en dos grandes grupos, los oncogenes y los genes supresores de tumores y dentro de los oncogenes; partiendo desde el exterior celular al interior y se pueden alterar factores genéticos por los mecanismos que ya vimos, receptores de factores de crecimiento que es el caso que nos compete hoy, los receptores humanos epidérmicos. Pueden alterarse las proteínas transmisoras de señales, habitualmente estos receptores desencadenan cascadas de fosforilación que generan una activación a nivel genético estimulando a su vez factores de transcripción que bien pueden estar alterados o reguladores del ciclo celular. En este caso lo que vamos a ver hoy es vinculado a la amplificación de receptores de factores de crecimiento.
Ahora nos vamos a centrar en la técnica del FISH y cómo se desarrolla. Esta herramienta se suele denominar citogenética molecular, molecular porque utilizar una sonda que es una secuencia de ADN, que va a hibridar, ser va a pegar complementariamente a un sitio especifico que yo conozco, esa sonda va aser marcada con fluorescencia de manera que la evidenciada de esa señal era captada a través de un microscopio de fluorescencia. Esta sonda se va a hibridar por complementariedad de bases a una secuencia especifica que yo quiero buscar. O sea que yo previo al desarrollo de la técnica de FISH debo saber cuál es el sitio que yo quiero buscar. Esa técnica se puede desarrollar tanto en células que se encuentran en interfase o sea que le material genético va a estar descompactado a nivel nuclear, eso va a tener a su vez determinadas características técnicas en la visualización de esa señalo en metafases que ya es un grado de concentración mayor del ADN en el cual la señal en ese caso es mucho más restringida y podemos ubicarlo sobre un cromosoma particular. Esto también se puede realizar con células en suspensión o en tejido solido que habitualmente vemos en cáncer gástrico para la detección de HER2 neu.
La sonda es un fragmento de ADN o ARN que tiene la capacidad de unirse a una región especifica de un ADN objetivo. Como consecuencia, tenemos que saber que alteración genética vamos a buscar para esa determinada patología, eso requiere conocimiento por parte del medico que solicita de los defectos más relevantes. No podemos solicitar un FISH para una patología hematológica o una leucosis por ejemplo. Es una herramienta que permite detectar las secuencias de ADN complementarias y son sondas bastante grandes, habitualmente la sonda marcada por desnaturalización e hibridización a la región complementaria se va a pegary evidenciamos dos señales a través del microscopio. Esta es la otra herramienta importante, conocer las características del microscopio de fluorescencia que no son las habituales utilizadas para las técnicas inmunológicas. Este microscopio evidencia una sonda que en relación a anticuerpos marcados puede ser pequeña la señal por lo cual la lámpara tiene que ser potente, que pueda ser capaz de estimular. Las sondas están unidas a moléculas fluorescentes por lo cual debemos tener en cuenta que estas moléculas tienen una luz que va a ser filtrada a una longitud de onda que va a excitar a esa molécula, la cual va aemitir una luz de emisión que nosotros la vamos a observar siempre y cuando tengamos el filtro adecuado. O sea que el microscopio además debe estar equipado con los filtros adecuado para ver los fluorosforos que yo tengo en la sonda de interés. Este microscopio tiene características diferenciales con el microscopio convencional. La luz de la lámpara que se emite pasa a través del filtro de excitación que selecciona la longitud de onda de excitación, siendo la molécula excitada y emite la señal que es lo que nosotros vamos a ver. Estos filtros deben ser tenidos en cuenta a la hora de seleccionarlos. En este caso esto es de las páginas de las sondas en los cuales se describen cuáles son los filtros adecuados, para los espectros de fluorescencia que necesitamos.
En cuanto a las características técnicas específicas, hay diferentes protocolos, se pueden hacer en células en solución y en tejido, lo importante para destacar es que si bien hay diferentes protocolos lo que se tiene que hacer posterior a la lámina que nos cede el anatomopatólogo es la desparafinización. Hay que destacar la colección que tiene que tener el técnico para realizar la técnica de FISH con el anatomopatólogo porque es importante la elección de la zona adecuada para poder realizar una correcta interpretación de las señales que estoy viendo. Pero básicamente consta de estos pasos después de las desparafinización o preparación de núcleos interfásicos o metafases, lleva a deshidratación en etanol, desnaturalización del ADN objetivo y de la sonda que a veces se hace aparte y a veces ser hace una co-desnaturalización, estos dos puntos se hacen a la vez y después se va a contra colorear para dar la contratinción de los núcleos. Si yo tuviera la muestra del paciente y la sonda de ADN, como vemos en esta fluorescencia in situ, en el caso de una lámina este ADN va a estar en la célula en la lámina que voy a mirar, en el caso de que sean células en suspensión yo voy a tener que hacer un preparado de células en el cual voy a tener el ADN del paciente y la sonda va a llevar una región especifica que va a ser marcada con fluorescencia y va a hibridar con un sitio determinado del ADN del paciente.
Posteriormente lleva una desnaturalización a los 82 grados, eso hace que las hebras se separen, esto se hace en un aparto parecido a un termociclador a los cuales se les colocan las láminas, elevando la temperatura para que se produzca la desnaturalización de las moléculas de ácidos nucleicos y posteriormente se pasa a una etapa de búsqueda de la secuencia complementaria y una vez lograda esta hibridización se va a evidenciar a través del microscopio de fluorescencia como una señal de determinado color ya sea en núcleos interfásicos, acá no se identifican los cromosomas, o en metafases. Hay diferentes tipos de sondas que debemos conocer, hay sondas de secuencias repetitivas, que marcan centrómeros o telómeros, que pueden ser a su vez un centrómero específico como el centrómero del cromosoma 12. O pueden ser telómeros específicos, en este caso es el cromosoma 4 que se marca con diferentes colores en brazo corto y brazo largo. Secuencias teloméricas generales que van a marcarse en todos los telómeros. Lo otro es la pintura cromosómica, eso es una secuencia de diferentes sondas que se van a combinar a lo largo del todo el cromosoma y se evidencian de esta manera. Esto ya requiere un software de interpretación donde se combinan los diferentes colores y sirve para ver específicamente alteraciones complejas, habitualmente en patologías que podemos tener metafases o en secuencias locus específicas. Son secuencias que hay de manera única en el genoma que tienen que pegar en determinado sitio en búsqueda de si tiene que estar presente o no. Habitualmente las sondas que se utilizan para HER2 neu son sondas locus específicas.
Si vemos el diseño de la sonda, cuando hablamos de una sonda locus específica, o sea de una región única, lo que obtengo es esto: vemos una sonda de aproximadamente 500 kilobases que pegan en esta región y no en otra del genoma que se evidencian si fueran cromosomas, pegan en un sitio del cromosoma determinado. Esto en interfase va a dar un núcleo que tiene dos señales, cuando un segmento se pierde lo que vamos a evidenciar en interfase es una señal sola. Cuando en este caso hay una polisomía aumenta el número de estos fragmentos, lo que voy a evidenciar es una trisomía, una amplificación. En el caso de que se amplifique muchas veces, yo voy a ver muchas señales en el núcleo. Esto es lo que más se utiliza en este tipo de secuencias para el HER2 neu. Hay otros tipos de diseño de sondas que se utilizan para otros tipos de anomalías en neoplasias. En este caso esta sonda el dual color single fusión, o sea que tiene dos colores, las sondas pegan a los lados de una región de ruptura conocida, lo que se ve habitualmente son dos señales rojas y dos señales verdes. En el caso de que haya una translocación, hay una sonda que se queda adyacente a la otra y se generaría una señal de fusión amarilla. En ese caso la evidencia de interfase seria de una verde, una roja y una amarilla. Esta es extrasignal siendo que el punto de ruptura está en el medio y queda un remanente de fluorósforo en uno de los cromosomas por lo cual quedan dos señales verdes, una amarilla y una roja. Esta es una sonda dual color break apart cuyo sitio de ruptura esta en el medio donde a un lado está la señal roja y al otro lado la verde. Estas señales se ven habitualmente en los microscopios de fluorescencia amarillas por lo cual en las señales normales serán dos señales amarillas. Cuando se produce la ruptura en este sitio vaya a donde vaya este segmento génico, se van a separar las señales entonces yo voy a diferenciar una señal roja, una amarilla y una verde. Y para terminar sin ánimo de entreverar, porque sé que puede ser complicado: existen estas sondas que son las dual color dual fusión que lo que hacen es extenderse a ambos lados del sitio de ruptura, esto generalmente ocurre para traslocaciones específicas que yo conozco los dos cromosomas involucrados de la translocación, el ejemplo más clásico puede ser la leucemia mieloide crónica en la translocación 922, las señales normales serian dos verdes y dos rojas. Cuando se produce la traslocación se producen dos señales de traslocación, por lo cual frente a una traslocación recíproca tendríamos una señal roja, una verde y dos amarillas. Esto es complejo pero la idea es transmitir que para realizar el FISH debemos tener en cuenta varias cosas, lo que hablamos de cual es la secuencia que requiero, que equipamiento tengo, que estoy buscando, cuales son los filtros que tengo en el microscopio para poder elegir la sonda adecuada, que diseño de sonda yo tengo para la búsqueda de la alteración que tengo porque de eso va a depender cual va a ser el patrón que yo voy a visualizar en el microscopio.
Primero tengo que conocer la enfermedad del paciente para conocer la utilidad clínica y debo trasmitirla al técnico que va a desarrollar la técnica. Segundo tengo que ver bien que es lo que quiero ver, cual es el gen que yo busco y eso va a ir de la mano con el valor que yo le doy a esa alteración. Esa alteración ¿tiene algún valor en esta patología? ¿tiene algún valor pronóstico o en el tratamiento del diagnóstico? ¿O aporta una valor casuístico y nada más? Y lo segundo es, para la alteración que yo busco ¿esta sería la técnica más adecuada? no hay que olvidar que cada sonda involucra una alteración si yo estoy buscando que alteraciones genómicas tiene el paciente con cáncer. Este no es el estudio adecuado. La utilización del FISH y algunos ejemplos como diagnostico como puede ser la leucemia mieloide crónica o la leucemia promielocítica, en este caso la traslocación 1507 o 922 como característica pronósticas como lo sugiere en Fondo Nacional de Recursos incluso en la parte de tratamientos del mieloma múltiple y la leucemia linfoide crónica y específicamente cáncer de mama y cáncer gástrico, evaluar si selecciono determinada población que puede ser adecuada la utilización de determinado tratamiento. Saber lo que se busca, conocer las sondas en profundidad, tener presente las posibles variantes que pueden haber desde el punto de vista genético porque eso me va ayudar en la interpretaciónde las señales y ver si la muestra que analizamos en representativa del tumor.
Y acá un poco la correlación con el anatomopatólogo. Si nosotros buscamos una población de P53 en un grupo celular puede presentar un 80% de la lesión sin embargo en otro no vamos a poder encontrar la lesión. Ventajas del FISH: es una técnica rápido, presenta alta eficiencia de hibridación y detección, análisis de numerosas células y células de división y es fundamental para aquellas patologías que no podemos obtener metafases o células de indivisión. Desventajas: alto costo, equipamiento, conocimiento del defecto buscado y capacitación técnica adecuada.
Para finalizar y teniendo en cuenta las características genéticas del HER2/Neu que desde el punto de vista genético tenemos una amplificación de esa región que generalmente va a generar una transcripción y traducción de esa proteína transmembrana que se va a ubicar en la superficie celular. (Human Epidermal Receptor) Como dijimos hay cuatro tipo de receptores en este caso el HER1 tiene una estructura tridimensional cerrada, que cuando llega al ligando se genera una apertura del receptor que le va a permitir de alguna manera dimerizar y juntarse en pares generando señales al núcleo de proliferación. El HER2 ya tiene la estructura desplegada o sea no necesita un ligando para abrirse y poder dimerizar. La dimerización del HER2 puede hacerse tanto como homodímero u heterodímero con algunos otros receptores 1,3 y 4. Esa dimerización va a estimular el núcleo para también la replicación en este caso tengo los cuatro tipos de dimerización, la estructura del HER2 es abierta como ya dijimos y la de los otros es cerrada hasta la llegada del ligando. Cuando llega al ligando la estructura de los otros receptores se abre y cuando se abre queda expuesto a la dimerización con otro par de receptor para generar el dímero y generar las señales. En este caso hay una amplificación a nivel genético que va a expresar una mayor cantidad de receptores HER2 que están en su forma abierta a nivel de la membrana celular. En el caso de HER2 la sobreexpresión génica empieza a expresar a nivel proteico más cantidad de HER2 que como no requiere el ligando de por si solo van a estar estimulando u homodimerizando HER2 con HER2 y van a estimular con mayor efectividad las señales de proliferación a nivel nuclear. Esto es simplemente para mostrar el mecanismo de Trastuzumab que lo que hace es un monoclonal que interfiere en la dimerización del HER2, este anticuerpo va a disminuir la proliferación celular por tres mecanismos básicos: el reconocimiento por células inmunes que pueden destruir la célula, eso favorece el reconocimiento del monoclonal al receptor, favorece a su vez la endocitosis en la degradación de los receptores. Y al estar el monoclonal impide la dimerización de la molécula.
En este caso tenemos un cáncer gástrico y sabemos que hay un beneficio fundamentalmente para la selección de los pacientes para tratamiento específico y tenemos una sonda adecuada para esa región. En la utilización de la sonda, lo que esta descrito es que pueden ser sondas únicas o sondas dobles, según se utilice solo la región HER2 o se utilice una combinación de una sonda para HER2 que está en el cromosoma 17 en el brazo largo con una sonda que pega en el brazo corto del cromosoma 17. Como bien dijo la Dra. Musto el algoritmo planteado es el que presentó, la utilidad del FISH en coordinación con la anatomía patológica se presenta cuando el score de inmunohistoquímica es 2+. En ese caso se retestean por FISH y me gustaría hacer algunas consideraciones, cuando se utiliza una sonda única lo que se establece para HER2 es que voy a considerarlo positivo cuando encuentro más de 6 señales, pero cuando encuentro entre 4 y 6 copias lo que se debe hacer es ampliar el número de copias visto para poder recatalogar la positividad o negatividad de la célula. En este caso lo que vemos es muchas señales rojas y muchas señales verdes. Cuando yo utilizo las dos sondas que pegan en HER2 y 17p voy a tener señales rojas y verdes. Lo habitual seria tener una señal verde de brazo corto y una señal roja que es HER2. Cuando encontramos células positivas, lo que va aumentar es el ratio o sea cuantas señales más HER2 hay sobre las señales 17p. Ese ratio me va ayudar a catalogar como positiva la célula para el FISH. Habitualmente el ratio para FISH debe ser mayor a 2. O sea que si yo encuentro dos señales verdes que pegan en el cromosoma 17p yo tengo que por lo menos tener 4 o más señales rojas como para poderlo catalogar como positivas. Siempre elegir la región, la muestra amplificada e inicialmente deben poderse contar 20 células que sean evaluables y del componente invasivo. Y en el caso de que sean border line o que genere duda frente a la positividad se deben analizar 20 células adicionales para poder catalogar.
Consideraciones a tener en cuenta: los laboratorios deben validar las técnicas de FISH y de inmunohistoquímica para eso muchos refieren una concordancia de 95% entre estas dos técnicas, debe tomarse en cuenta a la hora de realizar el diagnostico. Algunos laboratorios plantean que sería importante tener un volumen de 100 FISH a 250 IHQ anuales para considerar que la técnica tiene un flujo muy importante cosa que para nuestro país es bastante complejo. Simplemente para terminar, saber es conocer diferenciando, a medida que conocemos estas técnicas y vamos conociendo nuevas alteraciones vamos air seleccionando grupos que van a ser adecuados, para diferentes terapias que generalmente repercuten en una mejor sobrevida o por lo menos en una mejor calidad de vida del paciente. Muchas Gracias
Dr. Fornella: ¿no sé si hay alguna pregunta para cualquiera de estas dos charlas que acabamos de presenciar?
Consultante: como ustedes decían es muy importante para la selección del estudio el material y para el que hace FISH si se siente más cómodo recibiendo el bloque de parafina o prefiere ya que venga la lámina preparada y que lamina utiliza por si se necesita algún tipo de lámina especial.
Dr. Pablo López: simplemente quería decir que cuando hablamos con la Dra. Musto de la coordinación entre el patólogo y las personas que hacen el FISH, es realmente una coordinación práctica. Habitualmente el patólogo define el área, sabe que área es e incluso se marca esa área donde nosotros vamos a colocar la sonda de FISH. Creemos fundamental la comunicación y a interrelación entre los médicos para definir y aumentar de alguna manera la eficiencia de ese test.
Dra. Musto: en el bloque de parafina nosotros primero hacemos la lámina, hacemos la inmunohistoquimica y vemos la zona donde queremos hacer el estudio de amplificación de HER2+, que no haya necrosis, que este bien hecho, que no haya artefactos todo, ahí lo marcamos en el bloque porque uno pone la lámina, se ve el sitio, se marca con una lapicera el sitio y ahí es donde se les dice que tiene que hacer el estudio. Los procesamientos tienen que ser los mismos con las láminas.
Dr. Mauricio Cuello: Vos mandas el bloque de parafina marcado, no la lámina y ¿ustedes vuelven hacerle la inmunohistoquimica basándose en la marca del bloque y nada más? Porque muchas veces viene solo la marca del bloque y me imagino que muchas veces hay que repetir la inmunohistoquímica pues a nosotros nos pasa en la biología molecular que solo nos mandan el bloque y se pierden dos días cortando, montando creo que es un tema de coordinación global. Ustedes solo necesitan el bloque marcado y con esto es suficiente.
Dr. Pablo López: como te decía, del conocimiento que tengo el trabajo se hace en conjunto para la gente que hace FISH a veces no está acostumbrada a manejar el bloque y eso, entonces la ayuda del patólogo in situ, definiendo y viendo bien la lámina ayudando a la realizando del corte y definiendo el área es importante porque habitualmente y dependiendo de los centros de donde se haga pues entre ellos difieren, acá en Uruguay la parte del FISH en HER2 no sé cuál es el protocolo de procesamiento pero para mí es muy importante l ayuda del patólogo para definir, cortar y marcar el área de la lámina.
Dra. Musto: si no se marca por ejemplo en mama, como la tinción en homogénea no precisas marcar porque toda la lámina marcan casi un 100% de las células, sobre todo por la heterogeneidad. Puede que en una zona marque pero en otra no. En general en los lugares que se hace FISH hay patólogos que son los que ayudan.
Dr. Fornella: ¿alguna otra pregunta?
Consultante: tengo en este momento una paciente con dos resultados FISH uno positivo y otro negativo y me dicen que puede ser por la técnica. ¿a qué se refieren con la técnica? ¿hay falsos negativos?
Dr. Pablo López: en realidad los falsos negativos están vinculados a lo expuesto recientemente lo importante que resaltábamos en la validación de la técnica, tener pulido bien el protocolo de FISH, la evaluación de la misma sonda que se utiliza y parte de la experiencia del personal que lo realiza todos somos como granitos de arena que aportan para que la técnica sea pulida para que tenga una calidad técnica que te permita una señal interpretarla como positiva o negativa. Porque desde el punto de vista técnico puede haber muchas causas que puedan llevar que la sonda no pegue, no entre o que no tenga bien ajustado el protocolo de las temperaturas. Una vez considerando que esas cosas están bien tomadas y hechas creo que lo más importante pasa por elegir bien el área que vas a marcar. Para nosotros como país pequeño donde el volumen de muestra para determinados tipos de técnicas como esta son pocas, nos cuesta a veces tener aceitado el mecanismo como para tener una técnica repulida por eso es importante la práctica. Teniendo en cuenta todo esto lo que define la técnica es el área que vas a hibridar.
La positividad de esto, está dado por un ratio, cuando uno hace la técnica del FISH y específicamente estas sondas HER2 neu que son de dos colores su control de hibridación está dado por que la sonda verde 17p pega, eso quiere decir que se dieron todas las condiciones de hibridización habitualmente para que las sondas HER2 neu este pegada o sea que la positividad o negatividad la tengo que valorar si esta sonda está pegada, ese sería mi control. Existen dos sondas diferentes, una para mama y otra para gastro. A veces esto es difícil de manejarlo por parte de los oncólogos, se supone que cuando se te informa un resultado negativo el ratio de usarse la sonda de doble color, el ratio te asegura que la técnica funciono porque tu estas viendo tu control que es la señal verde.